تاثیر بار سطحی الکترودها روي برهم کنش جذبی یا دفعی پروتي ینها چکیده: الیاس علیپور هدایت االله قورچیان

Transcript

1 تاثیر بار سطحی الکترودها روي برهم کنش جذبی یا دفعی پروتي ینها * الیاس علیپور هدایت االله قورچیان تهران دانشگاه تهران مرکز تحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک "این مقاله در مجموعه سمینارهاي تحصیلات تکمیلی بیوفیزیک در مرکزتحقیقات بیوشیمی و بیوفیزیک دانشگاه تهران اراي ه گردید" چکیده: پروتي ین ها نقش بسیار اساسی درکاربردهاي پزشکی دارد. تثبیت پروتي ین روي سطوح جامد با جهت گیري درست نقش اساسی در رشد کاربرد پروتي ین ها جهت استفاده در زمینه هاي گوناگون بیوتکنولوژي مانند زیست حسگرها و میکروأري پروتي ین ها ایفا می کند. درنتیجه توجه بسیاري جهت فعالسازي سطح و بدنبال آن روش هاي عامل دار کردن جهت تثبیت این مولکول زیستی دیده می شود. درگزارش کنونی یافته هاي متفاوتی مانند تثبیت شیمیایی کوالان و غیر کوالان از پروتي ین ها و حفظ عملکرد پروتي ین در طی تثبیت مورد مرور قرار گرفته است. در این تحقیق از روش طیف سنجی مادون قرمز و تغییر ظرفیت خازنی براي تشخیص برهم کنش پروتي ین با سطح استفاده شده است. جذب پروتي ین در سطح الکترود طلا با اعمال پتانسیل تغییر می کند بگونه اي که هر چه بار الکترود بیشترو مخالف بار سطح پروتي ین ها باشد جذب پروتي ین افزایش می یابد همچنین نوع برهم کنش پروتي ین و جهت گیري آن وابسته به بار الکترود است و به گونه اي قرار می گیرد که بارهاي ناهم نام در کنار هم باشند. پس از قرارگیري پروتي ین روي سطح برهم کنش پروتي ین پروتي ین اتفاق می افتد و تا حدودي آرایش پروتي ین هاي سطحی تغییر می کند. کلید واژه: جذب پروتي ین ; دفع پروتي ین از سطح ; الکترود طلا ; الکترود داراي بار alipour5556@ut.ac.ir * نویسنده مسي ول تلفن تماس: الیاس علیپور پست الکترونیکی: 1

2 مقدمه پروتي ین ها در هنگام روبرو شدن با معرفهاي شیمایی یا تثبیت دچار دناتوراسیون می شوند اما نیرو پیشرفت در زمینه هاي کاربردي بیوسنسورها بیوکاتالیزورها و بیوآنالیزوره باعث شد تا علاقه جهت اتصال پروتي ین ها روي سطوح به صورت کنترل شده ویا انتخاب پذیري آن افزایش یابد.(مرجع 1 ) ازطرف دیگر آنها باید به گونه اي تثبیت شوند که گروه هاي عملکري و اصلی آنها درگیر نشود و این لازمه ي جهت گیري صحیح پروتي ین ها روي سطوح می باشد. به علاوه تکنیک هاي تک مرحله اي باید جایی ببکار برده شود که امکان آن وجود داشته باشد و از مراحل بعدي هزینه بردار جلوگیري شود (مرجع 2 ) تکنیکهاي متعددي براي تثبیت پروتي ین ها روي سطح گزارش شده است و به دو دسته تثبیت فیزیکی و تثبیت شیمیایی تقسیم بندي می شوند. اخیرا تکنیک تثبیت فیزیکی کمتر استفاده می شود زیرا دناتوراسیون پروتي ین و تکرار پذیري ضعیف در مقابل سهولت آن دیده می شود. تکنیک تثبیت شیمیایی تکرارپذیري و پوشش خوب نشان می دهد که به علت تثبیت کووالانی آن روي سطح می باشد. روش فلوي ورسانس و میکروسکوپ اتمی( (AFM جهت تعیین کمی جهت گیري و چگالی سطح براي پروتي ین ها روي سطح جامد و برسی توپوگرافی یک لایه استفاده می شود. با اطلاعات ساختاري که از پروتي ین موجود است این موضوع مقدور می شود که جزي یات برهمکنش اجزاي شرکت کننده بیومولکول و سطح فعال را پیش بینی کنیم بنابراین باقی مانده هاي آمینواسیدي قابل دسترس براي برهمکنش با گروه هاي فعال سطح مشخص می شود و شیمی سطح استفاده شده براي جهت گیري مطلوب الگوها را مشخص می کند. اخیرا جهت گیري پروتي ین ها روي سطح توسط ابزارهاي کامپیوتري پیش گویی می شود. در این مقاله اطلاعاتی در خصوص تاثیر بار الکترود روي میزان چگونگی جهت گیري پروتي ین برروي سطح غشاهاي طبیعی گزارشاتی مورد بررسی قرار می گیرد و همچنین کاربرد هاي تثبیت پروتي ین بر روي سطوح جهت کاربردهاي آنالیتیکی مطرح می گردد.(مرجع 2 تا 4 ) خواص مختلف پروتي ین ها موثر در جذب آنها الف- اندازه: هر چه اندازه یک پروتي ین بزرگتر باشد به خاطر بیشتر بودن جایگاه هاي اتصال تمایل پروتي ین به سطح بیشتراست. ب- بار سطحی پروتي ین: پروتي ین هایی که بار سطحی آنها نزدیک به نقطه ایزوالکتریک باشد بهتر و بیشتر جذب می شوند همچنین پروتي ین هاي با بارالکتریکی زیاد و مخالف بار الکترود جذب بیشتري دارند. ج- پایداري پروتي ین: هر چه پروتي ین پایداري کمتري داشته باشد و در تماس با سطح آنفولد شود به خاطر اینکه سطح تماس بیشتري پیدامی کند بهتر با سطح برهم کنش دارد پس جذب بیشتري نسبت به پروتي ین هاي پایدار دارد د-سرعت آنفولدینگ: هر چه سرعت آنفولد شدن یک پروتي ین بیشتر باشد سریعتر جذب سطح می شود 2

3 خواص سطوح که روي جذب تاثیر می گذارد الف- توپولوژي سطوح بزرگتر برهم کنش بیشتري با پروتي ین خواهد داشت پس جذب بهتري دارد هر چه سطح داراي انحنا و فرورفتگی باشد پس نسبت سطح در تماس افزایش می یابد و جذب بیشتر می شود. ب-ترکیب جنس شیمایی سطح نوع بر هم کنش ها را تعیین می کند و هر چه این بر هم کنش ها بهتر و بیشتر باشند آن نوع الکترود مناسب تر خواهد بود. ج- هیدروفوبیسیته سطوح هیدروفوب بسیار بیشتر به پروتي ین ها متصل می شوند. د- همگنی سطوح نا همگن بر هم کنش هاي متفاوتی با پروتي ین خواهند داشت زیرا هر چه نوع بر هم کنش متفاوتی با پروتي ین می تواند داشته باشد. ه- پتانسیل سطح پتانسیل سطح روي پراکندگی یونها در محلول و بر هم کنش با پروتي ین تا ثیر می گذارد پس می تواند فاکتور بسیار مهمی درجهت گیري و جذب پروتي ین روي سطح اثر بگذارد. اثر ورومن اثرورومن بیان می کند که در فرایند جذب پروتي ین هاي سرم به سطح الکترود ابتدا مولکول هاي کوچکتر به خاطرتحریک بیشتر جذب سطح می شوند و سپس جاي خود را به مولکولهاي بزرگتر با تمایل اتصال بیشتر می دهند. با توجه به شکل 1 همان طور که مشاهده می شود مطالعه دو پروتي ین مختلف که یکی اندازه کوچک (آپروتینین) و دیگري با اندازه بزرگ (لیزوزیم) انجام شده است ابتدا مولکول A که همان آپروتینین است جذب سطح می شود و سپس مولکول B که همان لیزوزیم است و مولکولی بزرگتر است جایگزین مولکول A می شود. شکل 1. ساختار شماتیکی از اثر ورومن. ابتدا مولکول با وزن مولکولی کم جذب سطح می شود و سپس مولکول بزرگ جایگزین می شود. 3

4 روشهاي انجام این مطالعه دراین مطالعه از سه تکنیک استفاده شده است و نتایج حاصل از آنها با یکدیگر مقایسه گردیده است درروش اول قرارگیري پروتي ین ها روي سطح به کمک برخورد اشعه مادون قرمز و جذب این اشعه بررسی شده است که همان روش طیف سنجی مادون قرمز است هر چه میزان جذب اشعه بیشتر باشد نشان دهنده ي وجود بیشتر پروتي ین درسطح است. درروش دوم قرار گیري پروتي ین ها روي سطح به تدریج یک لایه عایق بین سطح و الکترولیت ایجاد می کن که به صورت یک خازن عمل کرده و به تدریج ظرفیت این خازن به خاطر قرارگیري پروتي ین ها کاهش می یابد واین سیگنالی براي تشخیص جذب پروتي ین خواهد بود و در روش دیگر ولتامتري استفاده شده است که شبیه روش خازنی وجود پروتي ین درسطح شدت پیک هاي ولتامتري را کاهش می دهد و می توان با این روش مقدار جذب پروتي ین درسطح مطالعه کرد. نتایج و بحث پروتي ین ها در حالت عادي به خاطر داشتن اسید آمینه هاي اسیدي و بازي درسطح خود داراي بار الکتریکی هستند و وقتی دریک میدان الکتریکی قرار می گیرند برهم کنش میدان با بار الکتریکی پروتي ین ها نیرویی به پروتي ین وارد می کند که باعث حرکت پروتي ین می شود. همان طور که در شکل 2 مشاهد ه می شود جذب پروتي ین فیبرینوژن در پتانسیل هاي مثبت الکترود بیشتر است که این موضوع به دو روش خازنی و طیف سنجی مادون قرمز مطالعه شده است. این امر نشان دهنده بار الکتریکی منفی در سطح این پروتي ین است. همچنین این اثر روي دو پروتي ین دیگر آلبو مین سرم انسانی( HSA )و ایمنوگلوبولین LgG) G )مطالعه شده که اثر مشابه اثر فیبرینوژن مشاهده گردیده است (شکل 3 ). شکل 2. نمودار جذب پروتي ین فیبرینوژن بر روي الکترود طلا. (a) تغییرات خازنی و (b) تغییرات طیف سنجی مادون قرمز 4

5 شکل 3. تغییرات میزان جذب پروتي ین سرم آلبومین انسانی و ایمنوگلوبولین G در پتانسیلهاي مختلف مطالعه سینتیکی برهم کنش پروتي ن با سطح در شکل 4 پروتي ین فیبرینوژن با سطح الکترود طلا بر هم کنش داشته که فاکتور تتا در صد بر هم کنش جایگاه هاي اتصال الکترود با پروتي ین است که این فاکتور به خاطر دو مرحله اي بودن این اتصال به دو فاکتور تتا 1( 1 ϴ) و تتا 2 ( ϴ) 2 تقسیم می شود. در مرحله اول این واکنش پروتي ین به صورت ناپایدار به سطح متصل می شود که این که این فرآیند برگشت پذیر بوده و داراي ثابت تفکیک و اتصال می باشد تغییرات درصد پروتي ین هایی که به این صورت به سطح متصل میشوند با توجه به رابطه زیر محاسبه می گردد فرمول 1 در مرحله دوم پروتي ین از حالت ناپایدار به یک حالت پایدار تر درسطح تغییر وضعیت می دهد که تا حدودي باعث آنفولدینگ پروتي ین می شود. این تغییرات از رابطه زیر محاسبه می گردد فرمول 2. و در نهایت تغییرات کل براي درصد جذب پروتي ین از مجموع رابطه 1 و 2 به صورت زیرمحاسبه می گردد. فرمول 3. 5

6 4 جهت گیري پروتي ین در هنگام جذب در سطح در مطالعه اي دیگراثر بارالکتریکی سطح روي جهت گیري پروتي ین بررسی شده است که همانطور که در شکل مشاهده می شود در مرحله اولیه این اثرمولکولهاي پروتي ین در جهتی در سطح قرار می گیرند که بارهاي ناهمنام کاملا روبروي هم قرار گیرند و درغلظت بالا به تدریج میزان پروتي ین ها روي سطح افزایش می یابد و پروتي ین ها در کنار هم قرارمی گیرند و بر هم کنش پروتي ین پروتي ین باعث تغییر آرایش پروتي ین ها می شوند وبه نحوي که بهترین بر هم کنش را نسبت به یکدیگر داشته باشند. شکل 4. ساختار شماتیک از تغییرات جهت گیري پروتي ین بتا لاکتوگلوبولین در هنگام قرارگیري در مجاورت الکترود داراي بار منفی. نتیجه گیري مقدار جذب پروتي ین ها در سطح با افزایش تفاوت بارالکتریکی نسبت به سطح افزایش می یابد و هنگامی که PH محیط تغییر می کند میزان و نوع این بارهاي الکتریکی سطحی پروتي ین تغییر می یابد که باعث می شود میزان جذب پروتي ین نیز تغییر می کند. در دانسیته هاي پایین سطح جهت گیري پروتي ین ها در سطح الکترود باردار به نحوي است که بارهاي ناهمنام بیشترین برهم کنش را نسبت به هم داشته باشند و در دانسیته هاي بالا برهم کنش پروتي ین پروتي ین باعث تغییر آرایش جدید پروتي ین ها در سطح می شود. همچنین برهم کنش پروتي ین ها با سطح به نحوي است که فعالیت پروتي ین وهمچنین 6

7 پایداري پروتي ین حفظ می شود گر چه این فعالیت و پایداري تا حدودي کاهش می یابد ولی براي مطالعه روي پروتي ین روش مناسبی است. منابع: 1. S.E. Moulton, J.N. Barisci, A. Bath, R. Stella,b and G.G. Wallace, Investigation of protein adsorption and electrochemical behavior at a gold electrode, Journal of Colloid and Interface Science 261 (2013) Michael Rabe, Dorinel Verdes, Stefan Seeger, Understanding protein adsorption phenomena at solid surfaces, Advances in Colloid and Interface Science 162 (2014) Peiqing Ying, Ana S. Viana, Luisa M. Abrantes, Adsorption of human serum albumin onto gold: a combined electrochemical and ellipsometric study, Journal of Colloid and Interface Science 279 (2014) Kefeng Wang, Changchun Zhou, Youliang Hong, A review of protein adsorption on Bioceramics, Interface Focus (2015) 2,

8 Influence of Surface Charge of Electrode on the Adsorptive and Desorptive Behavior of Proteins Elyas Alipour*, Hedayatollah Ghourchian Institute of Biochemistry and Biophysics, University of Tehran, Tehran, Iran. Presented at the Postgraduate Biophysical Seminars, autumn 94 (2015) Abstract Introduction: Protein adsorption/desorption is predominantly influenced by the physicochemical properties of the surface and the protein, as well as by those of the bulk solution, such as the substrate and protein surface charge, substrate surface chemistry, solution ph, temperature, ionic strength, protein conformation in the solution and on the surface, its bulk concentration, etc. Methods: The effect of gold substrate surface charge (potential) on adsorptive/desorptive behavior of some proteins like fibrinogen (FG), human serum albumin (HSA) and immunoglobulin G was studied by employing differential capacitance (DC) and polarization modulated infrared reflection absorption spectroscopy (PM-IRRAS), and cyclic voltammetry (CV). Result and discussion: protein desorption measurements revealed that when the gold surface is polarized within the electrochemical double-layer region during the desorption process, the protein desorption kinetics is rather slow. However, within the regions of hydrogen and oxygen evolution, the protein desorption kinetics accelerates significantly, due to the physical removal of the adsorbed protein layer by gas bubbles evolving from the substrate surface, which enables a complete removal of the pre-adsorbed protein layer. Conclusion: The amount of adsorbed protein increased when a positive potential was applied to the electrode, while the application of a negative potential resulted in a decrease. Keywords: Protein adsorption, Protein desorption, Charged electrode, Gold electrode. Tel: Address: alipour5556@ut.ac.ir 8